Vi nang hóa chiết xuất cà phê đã qua sử dụng trong tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae thông qua sấy phun và đánh giá khả năng tiếp cận sinh học trong ống nghiệm
Tóm tắt
Cà phê đã qua sử dụng rất giàu các hợp chất hoạt tính sinh học, bao gồm axit chlorogenic, axit caffeic và caffeine, mang lại lợi ích cho sức khỏe. Tuy nhiên, quá trình tiêu hóa có thể làm phân hủy các hợp chất này; do đó, vi nang hóa trong tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae cung cấp một phương pháp mới để ổn định các hợp chất hoạt tính sinh học này trong quá trình tiêu hóa. Trên thực tế, điều quan trọng cần đề cập là kỹ thuật vi nang hóa này trong Saccharomyces cerevisiae chưa từng được áp dụng cho chiết xuất cà phê đã qua sử dụng.
Do đó, trong nghiên cứu này, chiết xuất cà phê đã qua sử dụng đã được vi nang hóa trong tế bào nấm men không bị co nguyên sinh (NPC) và bị co nguyên sinh (PC) bằng phương pháp sấy phun. Các đặc tính lý hóa của chiết xuất và vi nang hóa đã được mô tả và khả năng tiếp cận sinh học của các hợp chất hoạt tính sinh học đã được đánh giá bằng phương pháp tiêu hóa trong ống nghiệm. Hiệu suất bao (đóng) gói (EE) là 38,62% đối với NPC và 55,78% đối với PC, với khả năng tải (LC) lần lượt là 126,36 và 242 g/kg (theo Phương trình (1) và (2)). Sự hiện diện của các hợp chất chống oxy hóa, được xác định bằng HPLC trong cà phê đã qua sử dụng, đã được xác nhận trong các vi nang sử dụng FTIR.
Các xét nghiệm tiêu hóa trong ống nghiệm cho thấy khả năng tiếp cận sinh học cao hơn của các hợp chất hoạt tính sinh học trong pha ruột, lớn hơn 90% và tăng hoạt tính chống oxy hóa trong bia được làm bằng vi nang bị phân hủy bởi chất nguyên sinh (BPM). Những kết quả này cho thấy rằng vi nang nấm men ổn định hiệu quả các hợp chất hoạt tính sinh học của chiết xuất cà phê đã qua sử dụng, giải phóng chúng khắp đường tiêu hóa trong ống nghiệm, chủ yếu ở pha ruột. Do đó, các hợp chất được vi nang có thể đóng vai trò là chất phụ gia chức năng với tỷ lệ khả năng tiếp cận sinh học tốt trong đường ruột.
1. Giới thiệu
Cà phê là một trong những đồ uống được tiêu thụ nhiều nhất trên thế giới và phổ biến thứ hai sau trà đen [ 1 ]. Cà phê đã qua sử dụng là chất thải thu được từ quá trình chiết xuất cà phê hòa tan và đồ uống pha từ hạt cà phê xay. Chất thải này chiếm hơn 50% tổng trọng lượng của hạt cà phê rang, khiến nó trở thành một trong những chất thải quan trọng nhất, vì hơn 6 triệu tấn được tạo ra mỗi năm trên toàn thế giới [ 2 , 3 ].
Khối lượng lớn cà phê đã qua sử dụng được tạo ra có thể gây hại cho môi trường. Do đó, ngày càng có nhiều sự quan tâm đến việc sử dụng cà phê đã qua sử dụng, đặc biệt là vì nó chứa các hợp chất hoạt tính sinh học như axit caffeic, axit chlorogenic và caffeine. Các hợp chất hoạt tính sinh học trong cà phê đã qua sử dụng có hoạt tính chống oxy hóa và việc tiêu thụ vừa phải giúp ngăn ngừa các bệnh mãn tính không lây nhiễm [ 4 ]. Tuy nhiên, các hợp chất hoạt tính sinh học của cà phê đã qua sử dụng dễ bị phân hủy do các yếu tố môi trường và hóa học, chẳng hạn như nhiệt độ, độ pH, độ ẩm và các ion kim loại. Do đó, để tận dụng tốt hơn hoạt tính sinh học của các hợp chất này, các kỹ thuật vi nang hóa có thể được áp dụng để ổn định chúng bằng cách chọn vật liệu vi nang hóa phù hợp và tương thích [ 5 , 6 ].
Tế bào nấm men, ngoài việc có sẵn trên thị trường [ 7 , 8 ], như một hệ thống phân phối các hợp chất hoạt tính sinh học đã được nghiên cứu do nhiều lợi thế mà chúng mang lại, chẳng hạn như quy trình vi nang hóa khối lượng lớn và chi phí thấp cũng như sự an toàn của tế bào nấm men đối với dinh dưỡng của con người (vật liệu GRAS). Trong số các loài nấm men, một trong những loài nổi bật nhất là Saccharomyces cerevisiae do thành tế bào của nó được tạo thành từ một mạng lưới liên kết chéo của mannoprotein và β-1,3-glucan dạng sợi, giúp bảo vệ các hợp chất được vi nang hóa khỏi các yếu tố có hại [ 8 , 9 ].
Vi nang hóa là một kỹ thuật đã được áp dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm; nhiều nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả của tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae trong việc bao bọc tinh dầu, enzyme, terpen, ancaloit và hợp chất phenolic [10 , 11 , 12 , 13 , 14 ]. Hiệu quả bao bọc của hầu hết các hợp chất ưa nước như axit phenolic đã tăng lên nhờ các biện pháp xử lý trước như phân giải chất nguyên sinh, làm thay đổi thành phần lipid của màng tế bào chất, tăng tính thấm mà không làm thay đổi đáng kể thành tế bào, cải thiện khoảng không gian nội bào và giảm khả năng sống. Điều này cho phép ứng dụng trong các sản phẩm lên men như sữa chua. Rubio et al. [ 15 ] đã bổ sung các vi nang của S. cerevisiaeđược bổ sung chất tạo màu bã nho vào sữa chua, chứng minh việc sử dụng nấm men làm chất tạo màu và phụ gia thú vị cho quá trình sản xuất thực phẩm lên men, do đó mở ra khả năng ứng dụng chúng vào bia.
Bia là một loại đồ uống có cồn phức tạp và lâu đời và là loại đồ uống lên men được tiêu thụ nhiều nhất trên toàn thế giới. Khoảng 800 triệu hectolit bia được sản xuất hàng năm, tăng 14,3% vào năm 2023 [ 16 ]. Bia được tạo thành từ carbohydrate, khoáng chất, vitamin, axit amin, cồn etylic và các hợp chất phenolic. Các hợp chất phenolic trong bia có nguồn gốc từ mạch nha và hoa bia (lần lượt chiếm 70 và 30%), cung cấp các đặc tính cảm quan và sinh học cho đồ uống [ 17 ]. Tuy nhiên, các hợp chất này giảm trong quá trình ủ do nhiệt độ cao, lọc và lọc. Trong khi etanol có thể làm tăng nồng độ và đặc điểm của các hợp chất phenolic trong bia, thì mức tiêu thụ etanol vừa phải là tối đa 12 g etanol/ngày đối với phụ nữ và 24 g etanol/ngày đối với nam giới [ 18 , 19 ].
Hiện nay, nhu cầu phát triển các loại bia, ngoài việc đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng, còn có giá trị gia tăng đối với sức khỏe của người tiêu dùng ngày càng cao; do đó, việc kết hợp các chất phụ gia chức năng đã trở nên phổ biến trên toàn thế giới [ 20 ]. Việc bổ sung các vi nang vào bia có thể làm tăng hoạt động chống oxy hóa và hấp thụ sinh học trong đường tiêu hóa, làm tăng lợi ích của các hợp chất hoạt tính sinh học [ 21 , 22 ].
Nghiên cứu này lần đầu tiên nhằm mục đích vi nang hóa chiết xuất cà phê đã qua sử dụng bằng cách sử dụng các tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae đã bị co và không bị co . Theo đó, nghiên cứu đã đánh giá tác dụng bảo vệ của các tế bào nấm men này khi được sử dụng làm vật liệu bao nang và nghiên cứu các ứng dụng mới tiềm năng của chúng làm chất phụ gia chức năng trong bia thủ công. Hơn nữa, khả năng tiếp cận sinh học của các thành phần hoạt tính sinh học đã được đánh giá trong và sau quá trình tiêu hóa trong ống nghiệm.
2. Vật liệu và phương pháp
2.1. Vật liệu
Cà phê đã qua sử dụng được lấy từ một quán cà phê thương mại Starbucks® ở Hermosillo, Sonora (năm 2022). Bia thủ công kiểu stout được mua từ một nhà máy bia thủ công, “La Hache”, ở Hermosillo, Sonora (năm 2024). Các tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae được lấy từ chủng S-04 của nhãn hiệu Fermentis® . Các dung môi được sử dụng để phân tích sắc ký (HPLC) là methanol, axit formic và ethanol (JT Baker, Xalostoc, Thành phố Mexico, Mexico). Các tiêu chuẩn được lấy từ Sigma Aldrich Co. (St. Louis, MO, Hoa Kỳ), và nước Milli-Q được lấy từ EMD Millipore Corporation (Billerica, MA, Hoa Kỳ). Tất cả các thuốc thử đều đạt tiêu chuẩn phân tích.
2.2. Chiết xuất các hợp chất hoạt tính sinh học từ cà phê đã qua sử dụng
Như đã báo cáo trước đây, việc chiết xuất các hợp chất hoạt tính sinh học từ cà phê đã qua sử dụng được thực hiện thông qua các điều kiện tối ưu với phương pháp siêu âm sử dụng bể siêu âm, theo [ 23 ].
2.3. Xác định và định lượng chất chống oxy hóa trong cà phê đã qua sử dụng bằng HPLC
Việc xác định các hợp chất hoạt tính sinh học từ chiết xuất cà phê đã qua sử dụng được thực hiện với một số biến thể [ 24 ] bằng thiết bị sắc ký lỏng hiệu suất cao và máy dò mảng diode (HPLC-DAD, Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, Hoa Kỳ). Chiết xuất cà phê đã qua sử dụng khô được huyền phù lại trong ethanol 30% ( v / v ) cấp HPLC để tiêm. Các mẫu được lọc bằng bộ lọc nylon (0,22 μm) và sau đó được tiêm vào hệ thống (50 μL). Việc tách các phân tử được thực hiện bằng pha đảo ngược với cột C-18 HPLC (5 μm, 25 cm × 4 mm, Supelcosil TM LC-18, SUPELCO) (Supelco Inc., Bellefonte, PA, Hoa Kỳ) và sử dụng lưu lượng dung môi 0,500 mL/phút. Pha động A được axit hóa bằng nước với axit formic 5%, trong khi pha động B là methanol. Quá trình rửa giải được thực hiện bằng cách sử dụng gradient tuyến tính từ 100 đến 98% A ban đầu, duy trì trong 0–2 phút, lên đến 68% A trong 30 phút, từ 68 đến 60% A trong 0–8 phút, từ 60 đến 5% A trong 10 phút và 5% A trong 5 phút. Các hợp chất hoạt tính sinh học được xác định và định lượng bằng cách sử dụng đường chuẩn của các chuẩn thứ cấp (axit gallic, axit sinapinic, axit ferulic, axit caffeic, axit syringic, axit p-coumaric, axit chlorogenic và caffeine). Phương pháp này được thẩm định bằng giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) bằng phương pháp hồi quy tuyến tính với nồng độ bắt đầu từ 10 mg/mL của mỗi chuẩn được phân tích.
2.4. Xử lý tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae
Hoạt hóa tế bào nấm men được thực hiện bằng môi trường nuôi cấy YM. Môi trường được ủ ở 28 °C trong 72 giờ. Nấm men được phân lập bằng môi trường nuôi cấy YM với thạch. Các đặc điểm hình thái của nấm men được kiểm tra bằng kính hiển vi quang học và nhuộm xanh methylen. Sinh khối thu được được cô đặc bằng cách ly tâm ở tốc độ 5000 x g trong 15 phút ở 4 °C (Thermo Scientific) và bảo quản lạnh ở 4 °C.
2.5. Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae không bị nguyên sinh chất
Các tế bào không bị co nguyên sinh được xử lý theo [ 25 ] với các biến thể. Tế bào nấm men được đặt trong dung dịch đệm natri phosphat (pH 6,8) và rửa 5 lần bằng cách ly tâm với nước Milli-Q vô trùng ở tốc độ 5000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4 °C (Máy ly tâm Thermo Scientific). Các mẫu được bảo quản ở −20 °C để đông khô sau đó (với máy đông khô Labconco, Hoa Kỳ).
2.6. Sự nguyên sinh chất của tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae
Quá trình tế bào bị phân hủy theo chất nguyên sinh được thực hiện theo [ 25 ]. Các tế bào được treo trong dung dịch natri clorua (NaCl) ưu trương 10% ( w / v ) và lắc trên đĩa (Thermo Scientific TM , Waltham, MA, Hoa Kỳ) ở tốc độ 180 vòng/phút trong 48 giờ ở 55 °C. Các tế bào được rửa 5 lần bằng cách ly tâm (5000× g trong 15 phút ở 4 °C) và đông lạnh ở −20 °C để sấy khô bằng phương pháp đông khô (Labconco, Hoa Kỳ).
2.7. Vi nang hóa chiết xuất cà phê đã qua sử dụng trong nấm men Saccharomyces cerevisiae
Quá trình vi nang hóa các hợp chất hoạt tính sinh học được thực hiện theo [ 25 ] với các sửa đổi. Tỷ lệ 1:2 (chiết xuất:nấm men) được thêm vào nước để đồng nhất trên máy khuấy từ gia nhiệt (Thermo Scientific TM , Waltham, MA, Hoa Kỳ) ở tốc độ 180 vòng/phút và 40 °C trong 12 giờ (mối quan hệ chiết xuất:nấm men được tạo ra vì nếu có nồng độ nấm men cao hơn, có thể đảm bảo rằng toàn bộ chiết xuất được vi nang hóa). Cuối cùng, dung dịch được sấy khô bằng máy sấy phun (máy sấy phun LabPlant SD-Basic, LabPlant, Huddersfield, Vương quốc Anh) với nhiệt độ ban đầu hoặc đầu vào là 105 °C và nhiệt độ cuối cùng hoặc đầu ra là 55 °C. Lưu lượng cấp là 6 mL/phút, áp suất khí nén là 35 psi và cụm vòi phun là 0,5 mm với hệ thống phun sương quay. Các viên nang khô thu được được bảo quản ở nhiệt độ −20 °C.
2.8. Kính hiển vi điện tử quét (SEM)
Đặc điểm hình thái và đường kính được nghiên cứu bằng kính hiển vi điện tử quét (JEOL, JSM-7610F, Tokyo, Nhật Bản) hoạt động ở điện thế 15 kV. Các mẫu được phủ hỗn hợp vàng (Au)/palađi (Pd) trong buồng chân không khí argon.
2.9. Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (ATR-FTIR)
Phổ của cà phê đã qua sử dụng và chiết xuất vi nang được thu được bằng máy quang phổ ATR-FTIR ( Perkin Elmer, Waltham, MA, Hoa Kỳ) trong phạm vi số sóng từ 4000 đến 400 cm −1 và độ phân giải 4 cm −1 với 32 lần quét.
2.10. Phân tích nhiệt lượng vi sai (DSC)
Tổng cộng 10 mg mẫu được đặt trong các viên nang nhôm trong thiết bị đo nhiệt lượng (Mettler Toledo, Huddersfield, Vương quốc Anh) và sau đó được quét nhiệt độ từ 25 đến 350 °C trong môi trường khí nitơ với lưu lượng 25 mL/phút và tốc độ gia nhiệt 5 °C/phút.
2.11. Hiệu suất đóng (bao) gói (EE) và Khả năng chịu tải (LC)
Đánh giá khả năng tải và hiệu quả đóng gói của chiết xuất cà phê đã qua sử dụng trong các vi nang được thực hiện bằng phương pháp được trình bày chi tiết trong [ 26 ] với một số thay đổi. Các tế bào được rửa bằng 30% ethanol và sau đó được tạo viên bằng máy ly tâm ở tốc độ 5000× g ở 4 °C trong 15 phút (Thermo Scientific, Thành phố Mexico, Mexico). Sau đó, phần dịch trong được sử dụng để xác định nồng độ tổng phenol bề mặt (mg EAG/g). Mặt khác, các tế bào được siêu âm trong bể siêu âm (Branson Sonicator, Danbury, CT, Hoa Kỳ) với 30% ethanol trong 10 phút ở 30 °C và ly tâm ở tốc độ 5000× g trong 15 phút ở 4 °C (Thermo Scientific, Thành phố Mexico, Mexico). Tổng lượng phenol bên trong vi nang được định lượng (mg EAG/g). Hiệu quả đóng gói được xác định bằng Phương trình (1) và khả năng tải bằng Phương trình (2) [ 27 ].
- Hiệu suất đóng gói (%) = (Tổng phenol được đóng gói vi mô)/(phenol bề mặt) × 100 (1)
- Tải trọng = (Tổng phenol được bao bọc – phenol bề mặt)/(Tổng phenol chiết xuất) × 100 (2)
2.12. Tiêu hóa đường tiêu hóa trong ống nghiệm
Đối với thử nghiệm tiêu hóa các hợp chất chống oxy hóa, cần phải mô phỏng các điều kiện tiêu hóa dạ dày và ruột bằng phương pháp mô phỏng in vitro tĩnh của quá trình tiêu hóa thức ăn đường tiêu hóa theo quy trình chuẩn hóa INFOGEST 2.0 [ 28 ]. Các mẫu được sử dụng là bia không phụ gia (NAB), bia có chiết xuất cà phê đã qua sử dụng (BSCE), bia có vi nang không bị co nguyên sinh (BNPM) và bia có vi nang bị co nguyên sinh (BPM). Theo một nghiên cứu trước đây, chiết xuất cà phê là 100 mg bột chiết xuất cà phê đã qua sử dụng trộn với 10 mL bia và 200 mg bột vi nang với 10 mL bia, cũng như nồng độ phenol trong chiết xuất và vi nang [ 23 ].
2.12.1. Giai đoạn dạ dày (GP)
Tổng cộng 8 mL dung dịch muối GP với 5 mL mẫu được điều chỉnh đến pH 3, sau đó thêm 0,5 mL pepsin lợn (300 mg/mL) (2000 U/mL, Sigma Aldrich, CAS 9001-75-6) và 0,5 mL lipase tụy lợn (7 mg/mL) (60 U/mL, Sigma Aldrich, CAS 9001-62-1). Ủ trong 2 giờ ở 37 °C (Bể nước tuần hoàn chính xác Thermo Scientific , Marietta, OH, Hoa Kỳ).
2.12.2. Giai đoạn ruột (IP)
Tổng cộng 8,5 mL dung dịch muối IP được thêm vào các ống nghiệm thu được từ GP, và pH được điều chỉnh lại về 7. Tổng cộng 2,5 mL muối mật (7 mg/mL) (10 mM, Sigma Aldrich, CAS 8008-63-7) và 5 mL pancreatin lợn (5 mg/mL) (hoạt tính trypsin 100 U/mL) cũng được thêm vào. Dung dịch được ủ trong 2 giờ ở 37 °C (Bể nước tuần hoàn chính xác Thermo Scientific , Marietta, OH, Hoa Kỳ).
2.12.3. Thẩm phân (D)
Sự hấp thụ các hợp chất phenolic bằng phương pháp khuếch tán thụ động đã được mô phỏng. Dịch tiêu hóa của pha ruột được đặt trên màng cellulose. Định lượng được thực hiện để thu được tỷ lệ phần trăm khả năng tiếp cận sinh học của các hợp chất phenolic trong pha tiêu hóa bằng Phương trình (3). Định lượng tổng phenol từ quá trình thẩm phân được thực hiện bằng Phương trình (4).
- Khả năng tiếp cận sinh học (%) = (phenol pha tiêu hóa)/(phenol chưa tiêu hóa) × 100 (3)
- Khả năng tiếp cận sinh học (%) = (phenol chưa tiêu hóa – phenol thẩm phân)/(phenol chưa tiêu hóa) × 100 (4)
2.13. Chiết xuất lỏng-lỏng các hợp chất hoạt tính sinh học sau khi tiêu hóa
Tiến hành chiết xuất các hợp chất hoạt tính sinh học từ mỗi dịch tiêu hóa [ 29 ]: 2 mL của mỗi dịch tiêu hóa được đặt với 2 mL etyl axetat: etyl ete (50:50) và đồng nhất bằng máy xoáy trong 30 giây. Sau đó, pha hữu cơ được thu hồi và dung môi được loại bỏ bằng khí nitơ (N2 ) . Dung môi được huyền phù lại bằng etanol 30% ( v / v ) để tiến hành các phân tích tiếp theo.
2.14. Tổng số Phenol
Phân tích tổng phenol được thực hiện bằng phương pháp do [ 30 ] đề xuất với các sửa đổi. Tổng cộng 30 µL mẫu, 150 µL thuốc thử Folin-Ciocalteu 0,1 N và 120 µL natri cacbonat (Na2CO3 ) ở nồng độ 7,5% ( w / v ) được đặt vào giếng vi mô. Độ hấp thụ được đọc ở bước sóng 750 nm (Máy đọc vi mảng đa chế độ, Thermo Scientific, Waltham, MA, Hoa Kỳ) sau 30 phút trong bóng tối. Kết quả được báo cáo dưới dạng mg GAE trên g đối với mẫu khô và mg GAE/L đối với mẫu lỏng. Khoảng đường cong chuẩn là 0 đến 0,4 mg/mL, R2 > 0,99.
2.15. Thử nghiệm khả năng chống oxy hóa tương đương Trolox
Khả năng chống oxy hóa của các đương lượng Trolox được xác định theo [ 31 ] với một số thay đổi. Tổng cộng 280 µL gốc ABTS được đặt với 20 µL mẫu trong các giếng vi mô. Độ hấp thụ được phân tích trong máy đọc vi mảng ở bước sóng 734 nm (Máy đọc vi mảng đa chế độ, Thermo Scientific, Waltham, MA, Hoa Kỳ) sau 7 phút trong bóng tối. Khả năng chống oxy hóa được báo cáo bằng µMol đương lượng Trolox (TE)/g trọng lượng khô và mMol TE/g hoặc L. Khoảng đường cong chuẩn là 0 đến 0,5 mg/mL, R2 > 0,99.
2.16. Thử nghiệm khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH
Thử nghiệm DPPH được thực hiện theo [ 32 ] với một số sửa đổi. Gốc DPPH (0,008 mg/mL) được chuẩn bị trong methanol cấp thuốc thử, và độ hấp thụ ban đầu được điều chỉnh thành 0,7 ± 0,02. 20 µL mẫu. Tổng cộng 280 µL gốc DPPH được đặt trong một microplate, và độ hấp thụ thu được ở bước sóng 515 nm sau 30 phút trong bóng tối bằng máy đọc microplate ( Thermo Scientific, Waltham, MA, Hoa Kỳ). Kết quả được báo cáo là µMol TE/g và mMol TE/g hoặc L. Khoảng đường cong chuẩn là 0 đến 0,4 mg/mL, R2 > 0,99.
2.17. Kiểm tra FRAP
Thử nghiệm FRAP được thực hiện theo [ 33 ] với một số thay đổi. Tổng cộng 20 μL mẫu được đặt trong một đĩa vi mô và trộn với 280 μL hỗn hợp FRAP. Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 630 nm sau 30 phút trong bóng tối. Kết quả được báo cáo dưới dạng µMol đương lượng Trolox (TE)/g trọng lượng khô và mMol TE/g hoặc L. Khoảng đường chuẩn là 0 đến 0,4 mg/mL, R2 > 0,99.
2.18. Phân tích thống kê
Thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên đã được thực hiện, tất cả các nghiệm thức được lặp lại ba lần bằng phương pháp phân tích phương sai (ANOVA). So sánh các giá trị trung bình được thực hiện bằng kiểm định Tukey ( p ≤ 0,05) và hệ số tương quan Pearson. Phần mềm thống kê InfoStat phiên bản 2020 đã được sử dụng. Đồ thị được vẽ bằng chương trình SigmaPlot 12.0.
3. Kết quả
3.1. Xác định và định lượng các hợp chất hoạt tính sinh học
Bảng 1 cho thấy các hợp chất đã được xác định. Hợp chất chính là caffeine (28.919,13 ± 4,18 µg/g), tiếp theo là axit chlorogenic (4.349,42 ± 4,66 µg/g) và axit caffeic (880,14 ± 4,07 µg/g). Các hợp chất được xác định ở nồng độ thấp hơn là các hợp chất phenolic đơn giản như axit gallic (448,02 ± 5,74 µg/g) và axit syringic (412,87 ± 2,89 µg/g). Ngoài ra, các axit hydroxycinnamic cũng được xác định ở nồng độ thấp, chẳng hạn như axit p-coumaric (583,91 ± 6,34 µg/g), axit ferulic (484,23 ± 6,83 µg/g) và axit sinapinic (787,19 ± 4,66 µg/g).
Sự hiện diện của các chất chống oxy hóa này trong chiết xuất cà phê đã qua sử dụng là do quá trình sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp trong quá trình sinh trưởng của cây cà phê dưới điều kiện căng thẳng. Hơn nữa, nồng độ của các hợp chất hiện diện được quy cho loại đồ uống được tạo ra trước khi tạo ra sản phẩm phụ vì càng nhiều hợp chất còn lại trong đồ uống thì nồng độ của chúng trong cặn càng thấp [ 34 , 35 ]. Sự hiện diện của các hợp chất phenolic và caffeine trong cà phê đã qua sử dụng đã được báo cáo, chẳng hạn như trong [ 36 ], thu được nồng độ caffeine là 54.440,27 µg/g, 613,61 µg/g axit chlorogenic và 204,95 µg/g axit caffeic.
So với cuộc điều tra hiện tại, các tác giả đã báo cáo nồng độ caffeine cao hơn nhưng nồng độ axit chlorogenic và axit caffeic thấp hơn. Mặt khác, tài liệu tham khảo [ 37 ] đã báo cáo nồng độ caffeine là 3929 µg/g, thấp hơn nồng độ được báo cáo trong cuộc điều tra này. Sự khác biệt là do những thay đổi có thể có trong phương pháp canh tác, thu được sản phẩm phụ và quá trình chiết xuất các hợp chất hoạt tính sinh học [ 38 ]. Các kết quả hỗ trợ cà phê đã qua sử dụng như một nguyên liệu thô đầy hứa hẹn để chiết xuất các hợp chất hoạt tính sinh học như axit hydroxycinnamic, axit chlorogenic và caffeine. Axit chlorogenic là một chất chống oxy hóa mạnh, có tác dụng làm giảm tình trạng oxy hóa khử nội bào mất cân bằng.
Các xét nghiệm in vitro cũng đã báo cáo tác dụng chống viêm do giảm các loài nitơ phản ứng (RNS), các loài oxy phản ứng (ROS) và con đường truyền tín hiệu NF-κB [ 39 ]. Các nghiên cứu trước đây đã báo cáo rằng axit chlorogenic có khả năng tiếp cận sinh học qua hàng rào ruột nhưng ở mức độ thấp [ 40 ]. Do đó, điều quan trọng là phải tìm kiếm các công nghệ giúp tăng cường khả năng hấp thụ.
Bảng 1. Xác định và định lượng các hợp chất phenolic và caffeine từ chiết xuất cà phê đã qua sử dụng.
| Hợp chất hoạt tính sinh học | λ Tối đa | tR | [µg/g] | LOD [µg/g] | LOQ [µg/g] | R2 |
| Axit gallic | 270 | 3,53 | 448,02 ± 5,74 | 284 | 661 | 0,999 |
| Axit chlorogenic | 330 | 18,46 | 4349,42 ± 4,66 | 850 | 2577 | 0,993 |
| Axit cafeic | 320 | 20,35 | 880,14 ± 4,07 | 285 | 738 | 0,997 |
| Caffeine | 270 | 20.12 | 28.919,13 ± 4,18 | 4242 | 12.859 | 0,996 |
| Axit siringic | 320 | 22.09 | 412,87 ± 2,89 | 117 | 386 | 0,998 |
| axit p-cumaric | 320 | 26.15 | 583,91 ± 6,34 | 186 | 370 | 0,975 |
| Axit ferulic | 320 | 30.15 | 484,23 ± 6,83 | 114 | 347 | 0,976 |
| Axit sinapinic | 320 | 31,71 | 787,19 ± 4,66 | 122 | 565 | 0,982 |
Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, n = 3. LOD: Giới hạn phát hiện; LOQ: Giới hạn định lượng. LOD và LOQ được tính dựa trên hệ số hồi quy tuyến tính của đường chuẩn của từng chuẩn với các phương trình LOD = 3,3 σ/S và LOQ = 10 σ/S.
3.2. Kính hiển vi điện tử quét của tế bào nấm men và vi nang
Hình 1 cho thấy hình thái của tế bào không bị co nguyên sinh (NPC), tế bào bị co nguyên sinh (PC), vi nang không bị co nguyên sinh (NPM) và vi nang bị co nguyên sinh (PM). NPC được thể hiện trong Hình 1 A, B.
Hình thái có hình bầu dục với các đầu tròn và bề mặt đều đặn, và sự hình thành các tế bào nấm men nảy chồi đặc trưng đã được quan sát thấy, cho thấy các tế bào này có khả năng sống [ 40 ]. PC ( Hình 1 C, D) cho thấy sự kết tụ, biến dạng thành tế bào và giảm kích thước, cũng như các tế bào không có dấu hiệu nảy chồi. Sự khác biệt về hình thái giữa NPC và PC được cho là do quá trình plasmolysis, có nghĩa là tác dụng của dung dịch NaCl ưu trương gây mất nước qua thẩm thấu, làm giảm kích thước của tế bào và màng huyết tương ngăn cách tế bào với thành tế bào, gây mất độ căng, tạo thành các vùng lõm trên thành tế bào, làm biến dạng tế bào và thay đổi các đặc tính vật lý [ 41 , 42 ].
Sự khác biệt về hình thái giữa NPC và PC đã được báo cáo trong các nghiên cứu khác, chẳng hạn như [ 43 ], trong đó các tế bào nấm men S. cerevisiae bị phân hủy bằng các phương pháp khác nhau để nghiên cứu so sánh. Quá trình plasmolysis được thực hiện với 15% etyl axetat, thu được sự biến dạng của thành tế bào so với các tế bào sống tròn, nhẵn và căng. Tài liệu tham khảo [ 21 , 25 , 27 ] đã phân hủy tế bào nấm men bằng dung dịch NaCl ưu trương 10%, trong đó người ta cũng phát hiện thấy sự biến dạng và giảm đáng kể kích thước tế bào.
NPM ( Hình 2 A, B) cho thấy các tế bào hình bầu dục và mềm với hiện tượng sưng nhẹ, kết tụ và biến dạng ở thành tế bào do quá trình sấy phun quan sát được khi so sánh với NPC ( Hình 1 A, B). PM ( Hình 2 C, D) được quan sát thấy có độ trương nở cao hơn, với hiện tượng kết tụ rõ ràng hơn và biến dạng lớn hơn ở cấu trúc thành tế bào. Những kết quả này được cho là nhờ vào quá trình vi nang hóa; tức là, hiện tượng trương nở là do các tế bào được ngậm nước trong dung dịch nước có chiết xuất, điều này có thể làm tăng độ trương nở trong tế bào vì trong quá trình sấy, hàm lượng nước không bị loại bỏ bên trong tế bào và nhiệt độ cao của quá trình sấy phun có thể ảnh hưởng đáng kể đến cấu trúc của tế bào bằng cách làm biến dạng chúng [ 44 , 45 ].
Những kết quả này đã được các tác giả khác báo cáo khi sử dụng phương pháp sấy phun để vi nang hóa các hợp chất hoạt tính sinh học trong tế bào nấm men S. cerevisiae , bị co nguyên sinh và không bị co nguyên sinh, chẳng hạn như trong [ 25], đã đánh giá các hỗn hợp dung môi khác nhau (etanol:nước) để đưa axit gallic vào tế bào nấm men và quan sát thấy hiện tượng phồng lên ở các tế bào bị plasmolyte và biến dạng ở các tế bào không bị plasmolyte sau quá trình vi bao.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng quá trình plasmolysis của NaCl cung cấp nhiều không gian hơn cho việc nạp lõi bằng cách giải phóng nước, một số thành phần hòa tan trong nước như protein và axit nucleic, và một số enzyme từ tế bào, do đó tăng cường quá trình bao bọc các hợp chất. Hơn nữa, các nhà nghiên cứu khác cũng báo cáo dữ liệu tương tự về các chất kỵ nước và ưa nước được nạp vào tế bào nấm men S. cerevisiae , làm tăng không gian nội bào do quá trình plasmolyte, dẫn đến sự đồng thời của việc nạp lõi với việc giải phóng các vật liệu tế bào [ 10 ]. Năng suất của quá trình sấy có thể thay đổi tùy thuộc vào các yếu tố như tính chất của vật liệu cần sấy, thông số vận hành và thiết kế và bảo trì thiết bị.
Hình 1. Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae không bị co nguyên sinh ở 1500× ( A ) và 3000× ( B ) và tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae bị co nguyên sinh ở 1500× ( C ) và 3000× ( D ). Các mũi tên màu đỏ trong hình chỉ ra sự hiện diện của những thay đổi trong tế bào nấm men.
Hình 2. Các vi nang không bị co lại ở 1500× ( A ) và 3000× ( B ) và các vi nang bị co lại ở 1500× ( C ) và 3000× ( D ). Các mũi tên màu đỏ trong hình chỉ ra sự hiện diện của những thay đổi trong tế bào nấm men.
3.3. Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR)
Để xác nhận quá trình bao bọc các hợp chất hoạt tính sinh học vào tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae , FTIR đã được sử dụng. Phổ FTIR của chiết xuất cà phê đã qua sử dụng (SCE), NPC, PC, NPM và PM được thể hiện trong Hình 3.
Trong SCE, một đỉnh được quan sát thấy ở 3273 cm – 1 , được cho là do sự rung động của liên kết OH của nhóm hydroxyl ở 2924 và 2849 cm – 1 , cho thấy sự hiện diện của các rung động kéo dài CH của nhóm CH 3 và CH 2. Ở tần số thấp hơn, một đỉnh được quan sát thấy ở 1749 cm – 1 , đặc trưng cho sự kéo dài của liên kết đôi CO của nhóm carboxyl của hợp chất este và ở 1649 cm – 1 , đặc trưng cho sự kéo dài của liên kết đôi CC của vòng thơm của nhóm phenol. Ở 1595 cm – 1 , các dải kéo dài của liên kết đôi CC xuất hiện, chủ yếu là do caffeine. Cuối cùng, các đỉnh được quan sát thấy ở 1238 cm – 1 và 1032 cm – 1 , lần lượt là do sự kéo dài của liên kết este CO và dấu hiệu đặc trưng của sự hiện diện của axit chlorogenic. Các đỉnh này trong phổ SCE xác nhận sự hiện diện của các axit hydroxycinnamic được xác định trong nghiên cứu này bằng HPLC, được đặc trưng bởi nhóm phenol và axit cacboxylic của chuỗi bên, ngoài caffeine và axit chlorogenic (este) [ 46 ].
Các dải đặc trưng này đã được quan sát thấy trong các nghiên cứu khác, chẳng hạn như trong [ 47 ], đánh giá cà phê đã qua sử dụng bằng cách xử lý sấy sơ bộ ở 60 °C trước khi chiết xuất các hợp chất phenolic. Các tác giả đã báo cáo sự kéo dài của OH ở 3200 cm – 1 ; ở 1649 cm – 1 , sự kéo dài của liên kết đôi CC của nhóm thơm của nhóm phenol được quan sát thấy; và ở 1026 cm – 1 , sự xác nhận về sự hiện diện của axit chlorogenic được quan sát thấy.
Mặt khác, tài liệu tham khảo [ 48 ] đã đánh giá hạt cà phê xanh, thu được các đỉnh ở 1742 cm – 1 và 1115 cm – 1 của dao động tương ứng với các liên kết este; tuy nhiên, so với nghiên cứu này, sự dịch chuyển của các đỉnh được quan sát thấy có thể là do quá trình nhiệt và chiết xuất để thu được cà phê đã qua sử dụng. Các dải NPC thu được ở 3276 cm – 1 của dao động OH của nhóm hydroxyl của polysaccharides thành tế bào, ở 2913 cm – 1 và 2841 cm – 1, biểu thị độ rung của sự kéo dài CH của các chuỗi aliphatic của axit béo, 1640 cm − 1 và 1538 cm − 1 đặc trưng của amide I và amide II của protein, cũng như dải ở 1019 cm − 1 đặc trưng của β-glucan.
Kết quả về các nhóm chức năng của các thành phần tế bào nấm men đã được báo cáo: các tác giả của [ 27 ] đã phân giải tế bào nấm men S. cerevisiae bằng dung dịch NaCl ưu trương 10% và báo cáo sự dịch chuyển từ 3345 cm − 1 đến 3333 cm − 1 trong độ rung của liên kết OH của nhóm hydroxyl của polysaccharides sau quá trình phân giải tế bào nấm men, và tương tự như vậy, tham khảo. [ 44 ] tế bào nấm men S. cerevisiae bị phân hủy bằng 5% etyl axetat và báo cáo sự dịch chuyển trong tín hiệu nhóm hydroxyl từ 3200 cm – 1 đến 3250 cm – 1.
Đối với PC, chúng cho thấy sự dịch chuyển nhẹ ở các đỉnh, điều này được cho là do tác động của quá trình phân hủy bằng chất nguyên sinh lên các thành phần của thành tế bào, chủ yếu bao gồm polysaccharides, mannoprotein và axit béo đơn giản [ 49 ]. NPM cho thấy các dải ở 3274 cm – 1 của dao động OH, 2924 và 2849 cm – 1 của dao động kéo dài CH của axit béo và 1555 cm -1 của amide I của protein. Đỉnh quan sát được ở 1031 cm – 1 là đặc trưng của β-glucan.
So với NPC, người ta quan sát thấy cường độ các đỉnh giảm và không có đỉnh amide II trong NPM, điều này là do khả năng tương tác của các hợp chất phenolic với các thành phần của thành tế bào [ 50 ]. Các tương tác có thể được xác nhận bằng tín hiệu thu được từ β-glucan, được xác định rõ hơn trong NPM so với NPC do sự can thiệp của tín hiệu đặc trưng của axit chlorogenic. Điều này có thể chỉ ra sự tương tác thuận lợi của polysaccharides của thành tế bào với axit chlorogenic của chiết xuất cà phê đã qua sử dụng. Trong PM so với NPM, chỉ có sự giảm cường độ được thể hiện trong các dải được tìm thấy nhưng không có sự dịch chuyển, điều này có thể chỉ ra sự tương tác lớn hơn của các hợp chất hoạt tính sinh học với các hợp chất thành tế bào trong NPC. So với PC, điều này có thể chỉ ra rằng quá trình plasmolysis làm tăng quá trình bao bọc bên trong và do đó, làm ổn định các hợp chất hoạt tính sinh học [ 9 ].
Hình 3. Phổ FTIR của chiết xuất cà phê đã qua sử dụng (SCE), tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae không bị co nguyên sinh (NPC), tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae bị co nguyên sinh (PC), vi nang không bị co nguyên sinh (NPM) và vi nang bị co nguyên sinh (PM).
3.4. Nhiệt lượng kế quét vi sai
Phân tích nhiệt của SCE, NPC, PC, NPM và PM được thể hiện trong Hình 4. Trong SCE, một sự kiện pha thu nhiệt đã thu được ở 67,5 °C, liên quan đến sự bay hơi của nước, và một sự kiện khác ở 105 °C của quá trình phân hủy hoàn toàn các hợp chất phenolic [ 15 , 51 ].
Hình 4. Biểu đồ nhiệt DSC của chiết xuất cà phê đã qua sử dụng (SCE), tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae không bị co nguyên sinh (NPC), tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae bị co nguyên sinh (PC), vi nang không bị co nguyên sinh (NPM) và vi nang bị co nguyên sinh (PM).
Trong Ulloa et al. [ 52 ] đã sử dụng một phương pháp với kiềm và tự thủy phân để chiết xuất các hợp chất hoạt tính sinh học từ bã cà phê và thu được một biểu đồ nhiệt với đỉnh thu nhiệt ở 76,89 °C và 100,90 °C với sự phân hủy bắt đầu ở lần lượt 118 °C và 198 °C. Sự khác biệt trong sự phân hủy nhiệt của các hợp chất hoạt tính sinh học với nghiên cứu hiện tại chủ yếu là do phương pháp chiết xuất. NPC cho thấy hai đỉnh thu nhiệt, một đỉnh rộng ở 86 °C tương ứng với nhiệt độ bốc hơi nước và một đỉnh khác ít mãnh liệt hơn ở 174,9 °C tương ứng với sự hợp nhất của lớp kép phospholipid, cũng cho thấy sự phân hủy tế bào hoàn toàn ở 320,21 °C.
So với NPC, PC không cho thấy đỉnh thu nhiệt của sự bốc hơi nước nhưng cho thấy sự dịch chuyển trong sự hợp nhất của phospholipid, làm giảm nhiệt độ xuống 135 °C. Điều này là do quá trình plasmolysis, gây ra tình trạng mất nước tế bào và biến dạng màng tế bào chất, do đó phospholipid có thể có nhiệt độ chuyển pha thấp hơn nhiều từ gel sang tinh thể lỏng [ 52 , 53 ].
Các nghiên cứu như [ 27 ] báo cáo nhiệt độ 62 °C trong sự kiện bay hơi và 200 °C đối với sự hợp nhất của phospholipid và [ 54 ] báo cáo nhiệt độ nóng chảy là 207,88 °C đối với tế bào nấm men S. cerevisiae hoạt động. Tương tự như vậy, PM, so với PC, cho thấy đỉnh thu nhiệt ở 87 °C liên quan đến sự bay hơi của nước từ PM, có thể là do sự bù nước của tế bào trong quá trình vi nang hóa.
Đối với NPM và PM, ở 147 °C, điều này có thể là do sự phân hủy các hợp chất hoạt tính sinh học của chiết xuất cà phê đã qua sử dụng và cuối cùng là ở 205 °C từ sự hợp nhất của phospholipid của màng tế bào chất. Hơn nữa, sự phân hủy chất chống oxy hóa từ SCE so với NPM và PM cho thấy có sự gia tăng nhiệt độ phân hủy các hợp chất hoạt tính sinh học được quan sát thấy trong các vi nang, do đó tế bào nấm men đang ổn định các hợp chất hoạt tính sinh học liên quan đến sự gia tăng nhiệt độ, điều này xác nhận kết quả FTIR về sự tương tác của chiết xuất cà phê đã qua sử dụng với cấu trúc của tế bào nấm men S. cerevisiae .
3.5. Hiệu suất đóng gói (EE) và Khả năng chịu tải (LC)
Kết quả thu được từ định lượng tổng phenol của SCE, PM, NPM, vi nang bề mặt không bị co nguyên sinh (SNPM) và vi nang bề mặt bị co nguyên sinh (SPM) được thể hiện trong Hình 5 A. Nồng độ tổng phenol cao hơn được quan sát thấy trong SNPM (66,45 mg EAG/g dw) so với SPM (35,88 mg EAG/g dw); tuy nhiên, có nồng độ cao hơn trong PM (278,47 mg EAG/g dw) so với NPM (192,8 mg EAG/g dw) sau quá trình siêu âm.
Kết quả có thể là do xử lý co nguyên sinh trong tế bào vì có không gian nội bào lớn hơn và trên hết là tính thấm của màng tế bào lớn hơn, cho phép caffeine và axit phenolic có trong chiết xuất cà phê đã qua đi [ 27 , 45 ]. Tác dụng của quá trình phân hủy chất nguyên sinh cũng có thể được xác nhận trên khả năng tải của các hợp chất hoạt tính sinh học với việc định lượng thêm hiệu quả bao gói (EE) và khả năng tải (LC) [ 49 , 51 ].
Bảng 2 cho thấy tổng hàm lượng phenolic bên trong tế bào và hiệu quả bao gói. Một số tác giả đã báo cáo kết quả sử dụng tế bào nấm men bị phân hủy chất nguyên sinh, chẳng hạn như nghiên cứu được báo cáo bởi [ 27 ], trong đó dầu hạt rau sam được vi nang hóa trong tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae không bị phân hủy chất nguyên sinh và tế bào bị phân hủy chất nguyên sinh, báo cáo hiệu quả bao gói là 52,96–60,27% và khả năng tải là 186,87–211,68 g/Kg.
Mặt khác, tài liệu tham khảo [ 51 ] báo cáo hiệu quả bao gói là 23,10–43,10% và khả năng tải là 111,02–216,52 g/Kg. Khi so sánh, cả hai cuộc nghiên cứu đều có điểm tương đồng là phương pháp xử lý chất nguyên sinh có lợi cho tương tác nội bào và tăng hiệu suất đóng gói.
Hình 5. ( A ) Định lượng tổng phenol trong chiết xuất cà phê đã qua sử dụng (SCE), vi nang không bị co nguyên sinh (NPM), vi nang bị co nguyên sinh (PM), vi nang không bị co nguyên sinh bề mặt (SNPM) và vi nang bị co nguyên sinh bề mặt (SPM). ( B ) Bia không phụ gia (NAB), bia có chiết xuất cà phê đã qua sử dụng (BSCE), bia có vi nang không bị co nguyên sinh (BNPM) và bia có vi nang bị co nguyên sinh (BPM). Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Các chữ cái khác nhau (a, b, c, d, e) giữa các nghiệm thức có sự khác biệt đáng kể nếu p < 0,05.
Bảng 2. Hiệu quả đóng gói và khả năng tải trong vi nang.
| Vật mẫu | EE (%) | LC (g/Kg) |
| NPM | 38,32 b ± 0,32 | 246,96 b ± 8,41 |
| PM | 56,56 a ± 0,64 | 490,34 a ± 8,41 |
Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Các chữ cái khác nhau (a, b) giữa các phương pháp xử lý có sự khác biệt đáng kể nếu p < 0,05. Vi nang không bị phân hủy sinh học (NPM) và vi nang bị phân hủy sinh học (PM).
3.6. Tiêu hóa các viên nang siêu nhỏ được thêm vào bia thủ công
Định lượng tổng lượng phenolic của bia không phụ gia (NAB), bia có chiết xuất cà phê đã qua sử dụng (BSCE), bia có vi nang không bị co nguyên sinh (BNPM) và bia có vi nang bị co nguyên sinh (BPM) được thể hiện trong Hình 5 B.
NAB có nồng độ tổng lượng phenol thấp hơn (353,68 ± 3,88 mg EAG/L), so với BSCE, cho thấy nồng độ tổng lượng phenol trong bia tăng đáng kể ( p < 0,05) lên tới 747,45 ± 3,36 mg EAG/L sau khi thêm chiết xuất cà phê đã qua sử dụng không bị co nguyên sinh. Trong các mẫu bia có vi nang, sự gia tăng lớn hơn trong định lượng phenol đã được quan sát thấy ở BNPM (564,87 ± 3,45 mg EAG/L) so với BPM (463,94 ± 7,36 mg EAG/L), như đã chứng minh trước đây. NPM có nồng độ tổng phenol cao hơn trên bề mặt tế bào, cho phép tương tác lớn hơn với môi trường và định lượng tổng phenol lớn hơn trước khi tiêu hóa.
Việc bổ sung chiết xuất vào bia thủ công đã được báo cáo là làm tăng đặc tính chống oxy hóa của đồ uống, như được thể hiện trong [ 52 ], trong đó đã thêm chiết xuất keo ong vào bia thủ công ở các nồng độ khác nhau để tối đa hóa việc bổ sung các hợp chất phenol, thu được sự gia tăng tổng phenol từ 242 lên 306,5 mg EAG/L. So với nghiên cứu này, sự gia tăng nhỏ hơn trong nồng độ phenol đã được quan sát thấy sau khi bổ sung chiết xuất không được vi nang, điều này là do bản chất của nguyên liệu thô được sử dụng để chiết xuất các hợp chất hoạt tính sinh học.
Tác động của các giai đoạn dạ dày, ruột và thẩm phân lên khả năng tiếp cận sinh học của tổng phenol trong NAB, BSCE, BNPM và BPM được thể hiện trong Bảng 3.
NAB và BSCE cho thấy sự giảm đáng kể ( p < 0,05) khi các giai đoạn tiêu hóa tiến triển, đạt được khả năng tiếp cận sinh học trong ruột lần lượt là 38,78 và 39,65%. Điều này là do sự tương tác của các hợp chất phenolic với môi trường của chúng, bao gồm các tương tác ion và cộng hóa trị với các phân tử khác có trong ma trận thực phẩm hoặc giai đoạn tiêu hóa, các hoạt động của enzym lipase và pepsin, và sự thay đổi pH, gây ra sự phân hủy các hợp chất hoạt tính sinh học trong cà phê đã qua sử dụng [ 53 ].
Tác động của các giai đoạn tiêu hóa lên khả năng tiếp cận sinh học của các hợp chất hoạt tính sinh học đã được các tác giả khác đánh giá trong các loại thực phẩm và đồ uống khác nhau, chẳng hạn như trong [ 54 ], đánh giá tác động của quá trình tiêu hóa lên khả năng tiếp cận sinh học của các hợp chất phenolic trong bã nho, đạt được khả năng tiếp cận sinh học là 122% trong giai đoạn ruột; như [ 55 ] đã làm, thu được kết quả tương tự với bã bí ngô hữu cơ với khả năng tiếp cận sinh học 116,3% trong giai đoạn ruột. So với nghiên cứu này, khả năng tiếp cận sinh học thu được trong giai đoạn ruột ở các mẫu NAB và BSCE thấp hơn nhiều. [ 56 ] cũng quan sát thấy xu hướng tương tự.] trong quá trình đánh giá khả năng tiếp cận sinh học của rượu vang đỏ thông qua quá trình tiêu hóa, báo cáo cho thấy sự giảm dần khi quá trình tiêu hóa diễn ra, với sự mất mát phenol rõ rệt hơn ở giai đoạn dạ dày.
Tương tự như vậy, tài liệu tham khảo [ 57 ] đã đánh giá khả năng tiếp cận sinh học của cà phê, quan sát thấy nồng độ phenol giảm dần trong suốt các giai đoạn tiêu hóa, tương tự như nghiên cứu này. Các giá trị khả năng tiếp cận sinh học lớn hơn 100% chỉ ra rằng các hợp chất hoạt tính sinh học được giải phóng khỏi ma trận thực phẩm và/hoặc được chuyển hóa từ các hợp chất hoạt tính sinh học phức tạp hơn. Enzym, độ pH và tác động của muối mật trong môi trường dạ dày và ruột có thể gây ra sự thay đổi trong cấu trúc hóa học của các hợp chất phenol, tạo ra các phân tử mới có khả dụng sinh học và hoạt động sinh học khác nhau; do đó, sự khác biệt và điểm tương đồng là do nồng độ phenol tự do và liên hợp trong ma trận thực phẩm [ 58 ].
Thực phẩm rắn chủ yếu bao gồm các phenol liên hợp có thể được giải phóng thông qua hoạt động của enzym, trong khi đồ uống giàu hợp chất phenolic tự do, cho phép tiếp xúc nhiều hơn với các tương tác vật lý và hóa học với môi trường của chúng và có thể gây ra sự phân hủy các hợp chất hoạt tính sinh học [ 59 ].
Trong các mẫu BNPM và BPM, sự khác biệt đáng kể ( p <0,05) đã được quan sát thấy ở giai đoạn tiêu hóa; tuy nhiên, không giống như NAB và BSCE, các loại bia có vi nang cho thấy khả năng tiếp cận sinh học của các hợp chất hoạt tính sinh học tăng lên trong giai đoạn ruột: 96,79% ở BNPM và 107,81% ở BPM. Có thể quan sát thấy rằng trong giai đoạn dạ dày, có sự giảm các hợp chất phenolic có thể là do tương tác vật lý và hóa học với môi trường. Đây là nơi các enzym (pepsin và lipase) bắt đầu phân hủy các thành phần của thành tế bào nấm men, chẳng hạn như axit béo. Khi đến giai đoạn ruột, cấu trúc tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae bị sụp đổ khi nó tương tác với phức hợp pancreatin được sử dụng trong quá trình tiêu hóa trong ống nghiệm. Pancreatin, được tiết ra bởi tuyến tụy trong hệ thống sống, thủy phân protein và lipid bằng cách mô phỏng màng phospholipid của tế bào vốn đã bị tổn thương cấu trúc do quá trình nguyên sinh, tạo điều kiện cho quá trình phân hủy enzym của cấu trúc tế bào [ 8 ].
Trong tất cả các mẫu, khả năng tiếp cận sinh học trên 90% đã được quan sát thấy sau khi thẩm phân, cho thấy tổng số phenol được tìm thấy trong pha ruột có tỷ lệ hấp thụ cao bằng cách khuếch tán thụ động qua ruột [ 60]. Kết quả thu được có thể liên quan đến tính ổn định của các hợp chất hoạt tính sinh học trong chiết xuất cà phê đã qua sử dụng được vi nang hóa trong tế bào nấm men trước các yếu tố môi trường có thể phân hủy chúng. Điều này cho thấy hiệu suất vi nang hóa tốt hơn và khả năng tiếp cận sinh học cao hơn của các hợp chất hoạt tính sinh học trong tế bào nấm men (PM) vì chúng có tỷ lệ cao hơn ở cấp độ nội bào so với các tế bào không bị co nguyên sinh.
Bảng 3. Định lượng tổng phenol, khả năng tiếp cận sinh học và hoạt tính chống oxy hóa của bia thủ công sau khi tiêu hóa trong ống nghiệm.
| Giai đoạn | Vật mẫu | Tổng số Phenol (mg GAE/L) |
Khả năng tiếp cận sinh học (%) | DPPH • (mMol TE/L) |
ABTS •+ (mMol TE/L) |
FRAP (mMol TE/L) |
| Dạ dày | NAB | 213,55 b ± 1,56 | 60,37 | 0,78b ± 0,02 | 0,58 b ± 0,10 | 0,25b ± 0,03 |
| BSCE | 459,56 b ± 2,13 | 61,48 | 1,32 b ± 0,24 | 0,96 b ± 0,27 | 0,58b ± 0,06 | |
| BNPM | 365,11 b ± 2,67 | 64,67 | 1,09 c ± 0,13 | 0,86c ± 0,17 | 0,9c ± 0,08 | |
| BPM | 302,13 c ± 2,87 | 65,17 | 0,89c ± 0,04 | 0,74c ± 0,14 | 0,8c ± 0,05 | |
| Đường ruột | NAB | 137,16 c ± 2,24 | 38,78 | 0,31c ± 0,01 | 0,24c ± 0,03 | 0,09c ± 0,01 |
| BSCE | 296,37 c ± 1,38 | 39,65 | 0,71c ± 0,09 | 0,34c ± 0,09 | 0,14c ± 0,02 | |
| BNPM | 546,43 a ± 2,6 | 96,79 | 1,44 a ± 0,07 | 0,87 a ± 0,06 | 0,89 a ± 0,13 | |
| BPM | 499,74 a ± 1,43 | 107,81 | 1,39 a ± 0,32 | 1,01 a ± 0,17 | 1,09 a ± 0,26 | |
| Thẩm
phân |
NAB | 30,29 ngày ± 1,72 | 91,43 | 0,09 ngày ± 0,01 | 0,02 ngày ± 0,01 | 0,01 ngày ± 0,00 |
| BSCE | 53,19 ngày ± 1,93 | 92,88 | 0,14 ngày ± 0,03 | 0,06 ngày ± 0,01 | 0,05 ngày ± 0,01 | |
| BNPM | 46,6 ngày ± 0,87 | 91,74 | 0,09 ngày ± 0,01 | 0,02 ngày ± 0,01 | 0,02 ngày ± 0,01 | |
| BPM | 35,34 ngày ± 0,33 | 92,37 | 0,11 ngày ± 0,01 | 0,04 ngày ± 0,01 | 0,03 ngày ± 0,01 |
Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Các chữ cái khác nhau (a, b, c, d) giữa các phương pháp xử lý có sự khác biệt đáng kể nếu p < 0,05. Bia không phụ gia (NAB), bia có chiết xuất cà phê đã qua sử dụng (BSCE), bia có vi nang không bị co nguyên sinh (BNPM) và bia có vi nang bị co nguyên sinh (BPM).
Những thay đổi trong định lượng hoạt động chống oxy hóa chịu ảnh hưởng của các pha tiêu hóa trong các mẫu NAB, BSCE, BNPM và BPM được thể hiện trong Bảng 3.
Hoạt động chống oxy hóa giảm khi các pha tiêu hóa tiến triển trong các mẫu NAB và BSCE; ngược lại, trong các mẫu BNPM và BPM, hoạt động chống oxy hóa tăng trong pha ruột. Ngoài ra, có thể thấy rằng có mối tương quan cao giữa tổng phenol và định lượng hoạt động chống oxy hóa được đánh giá bằng hệ số tương quan Pearson với p < 0,05, lớn hơn một chút với ABTS •+ với giá trị R = 0,91, tiếp theo là DPPH với R = 0,89 và FRAP với R = 0,79. Điều này chỉ ra rằng các hợp chất chiết xuất cà phê đã qua sử dụng, chẳng hạn như axit chlorogenic và caffeine, có thể cung cấp hầu hết hoạt động chống oxy hóa với cơ chế chuyển nguyên tử hydro (HAT) và các hợp chất ưa nước so với DPPH • , chủ yếu phản ứng với các hợp chất kỵ nước và FRAP, với cơ chế hoạt động của cơ chế chuyển điện tử đơn (SET).
Tuy nhiên, mối tương quan của Pearson không hoàn toàn tuyến tính, vì vậy hoạt động chống oxy hóa, mặc dù chủ yếu được cung cấp bởi các hợp chất hoạt tính sinh học của chiết xuất cà phê được vi nang hóa, nhưng cũng được cung cấp ở một mức độ nào đó bởi các thành phần hoạt tính sinh học của bia. Ngoài ra, kết quả tiêu hóa vi nang hóa các hợp chất hoạt tính sinh học của cà phê đã qua sử dụng cho thấy các hợp chất đang được ổn định bởi các tế bào nấm men và được giải phóng trong giai đoạn ruột, khi đó sự hấp thụ lớn hơn các hợp chất phenolic qua hàng rào (microvillus) của ruột có thể xảy ra thông qua một số cơ chế, bao gồm cả khuếch tán thụ động [ 16 , 52 , 60 ].
4. Kết luận
Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae hoạt động như một vật liệu thành bao bọc, ổn định các hợp chất hoạt tính sinh học của chiết xuất cà phê đã qua sử dụng chống lại các yếu tố môi trường như nhiệt độ cao.
Ngoài ra, quá trình phân hủy chất nguyên sinh làm tăng hiệu quả bao bọc và khả năng chịu tải trong các vi nang. Các tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae được vi nang hóa đã bảo vệ và định hướng các hợp chất hoạt tính sinh học của chiết xuất cà phê đã qua sử dụng được thêm vào bia thủ công trong quá trình tiêu hóa trong ống nghiệm.
Việc bổ sung chiết xuất cà phê đã qua sử dụng và các vi nang đã làm tăng chức năng của bia. Những vi nang này có thể được sử dụng trong bia đen và các loại thực phẩm hoặc đồ uống khác cần tăng cường các đặc tính chức năng của chúng. Do đó, các vi nang thu được có thể được sử dụng làm phụ gia chức năng trong ngành công nghiệp thực phẩm.
Viết tắt
Các chữ viết tắt sau đây được sử dụng trong bản nghiên cứu này:
| NPC | Non-plasmolyzed cell | Tế bào không bị nguyên sinh chất | |
| PC | Plasmolyzed cell | Tế bào nguyên sinh bị phân hủy | |
| NPM | Non-plasmolyzed microcapsule | Vi nang không bị nguyên sinh | |
| PM | Plasmolyzed microcapsule | Vi nang đã bị nguyên sinh chất | |
| NAB | Non-additive beer | Bia không phụ gia | |
| BSCE | Beer with spent coffee extract | Bia có chiết xuất từ cà phê đã qua sử dụng | |
| BNPM | Beer with non-plasmolyzed microcapsules | Bia có vi nang không bị đông tụ | |
| BPM | Beer with plasmolyzed microcapsules | Bia có vi nang bị đông tụ | |
| EE | Encapsulation efficiency | Hiệu quả đóng gói | |
| LC | Load capacity | Khả năng chịu tải | |
| SCE | spent coffee extract | chiết xuất cà phê đã qua sử dụng | |
| SPM | superficial plasmolyzed microcapsule | vi nang bề mặt bị phân hủy | |
| SNPM | superficial non-plasmolyzed microcapsule | vi nang bề mặt không bị co nguyên sinh |
*Tìm hiểu thêm về máy sấy phun LabPlant SD-Basic:
Đóng góp của bài viết từ nhóm R&D Công ty Thiết bị Ngày Nay
Đây là bài báo khoa học nghiên cứu điển hình về tính ứng dụng từ thành tựu sản phẩm thiết bị khoa học công nghệ, đặc biệt liên quan tới công nghệ sấy phun nano, và điển hình cho cho nghiên cứu này là thông qua sử dụng máy sấy phun SD-Basic Labplant (UK) do công ty Thiết bị Ngày Nay hiện đang đại diện phân phối tại Việt nam, trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm.
Nghiên cứu này được đội ngũ team R&D Công ty Thiết bị Ngày Nay trích dẫn tổng hợp từ nguồn thông tin dữ liệu khoa học mở, nhằm cung cấp góc nhìn, xu hướng tiếp cận cho các nghiên cứu ứng dụng trong nước, liên quan tới lĩnh vực xu hướng hiện nay về sản xuất tổng hợp vật liệu mới có tính ứng dụng thực tiễn cao.
Thông tin như là nguồn tư liệu quý giúp các nhà máy, bộ phận nghiên cứu R&D tham chiếu, lựa chọn định hướng phương pháp nghiên cứu và phát triển quy trình sản xuất hiệu quả tối ưu nhất.
(*Lưu ý: Cần ghi rõ nguồn thông tin khi phát hành lại nội dung từ website www.thietbingaynay.com)
